Fixação de tecidos para exame histopatológico

A fixação é um passo fundamental do processo do exame histopatológico e ocasionalmente negligenciada. A má fixação pode impossibilitar o êxito do exame histopatológico.

O processo de fixação se baseia em manter, de modo definitivo, as estruturas citológicas e histológicas das células e tecidos, evitando a degradação do material em decorrência de fenômenos autolíticos. Permite ainda a realização de inúmeras técnicas citológicas e histopatológicas.
Há diversas formas de se fixar um tecido, sendo a fixação obtida através do uso de substâncias químicas (fixadores) a mais adequada.

O formol:

O fixador mais utilizado para histopatologia diagnóstica é o formol a 10% (aldeído fórmico), devido ao seu baixo custo e simplicidade de uso.
O formol por ser extremamente volátil, provoca irritação dos olhos e vias respiratórias.
O aldeído fórmico precipita em concentrações superiores a 40%. Desta forma, chamamos a solução de formol a 40% de "formol puro".

Como todo aldeído, o formol é instável e um dos produtos de sua degradação é o ácido fórmico. Tal ácido freqüentemente interage com a hemoglobina produzindo um pigmento acastanhado chamado de "pigmento de formol" ou hematina. O uso de solução tampão evita a acidificação do fixador, impedindo assim o aparecimento do pigmento de formol.

Como o formol atua:

 
O aldeído fórmico atua como fixador interagindo com os aminoácidos lisina e arginina. Tal fixador não provoca precipitação de proteínas, não preserva gorduras livres, porém fixa lipídeos complexos. Provoca ainda, leve precipitação de outros constituintes celulares e não é o fixador de eleição para carboidratos. A capacidade de penetração do formol no tecido varia de um a três milímetros por hora, na dependência da qualidade do material. 

Preparando o formol para fixação:

Na prática diária não se é usado a solução de formol tamponada e sim uma solução simples de formol, feita a partir do aldeído fórmico e água corrente, seguindo a seguinte diluição:

Formol puro (formol 40% P.A.).............................100 ml
Água Corrente.....................................................900 ml

Com a proibição da distribuição de formol a 40% em muitos locais de país, tornou-se comum adquirir o formol a 10% e nestes casos a regra prática é:

Formol 10% - uma parte

Água corrente – uma parte

Com esta diluição a concentração de formol será um pouco superior à anterior, sem prejudicar em nada a qualidade da fixação.

Nos locais onde há disponibilidade de confeccionar o formol tamponado, seguir as seguintes diretrizes:

Formol puro (formol 40% P.A.).............................100 ml
Água Destilada...................................................900 ml
Fosfato de sódio monobásico................................ 4,0 g
Fosfato de sódio dibásico...................................... 6,5 g

REGRAS GERAIS E PRÁTICAS PARA UMA BOA FIXAÇÃO
 

1. Fixe tecido o mais rápido possível depois da retirada;
2. Não fixe fragmentos com mais de 6 mm de espessura, pois o fixador possui capacidade de penetração lenta, se o fragmento for muito espesso haverá autólise no centro do tecido;
3. Evite: pinçar, tracionar ou manipular em excesso os tecidos;
4. Use sempre um volume de fixador superior a 10 vezes o volume da peça, por exemplo: se o fragmento medir 0,6 mm de aresta, usar pelo menos 6,0 ml de formol a 10%;
5. Se o tecido for delgado, como a parede de um órgão tubular, promova a aderência do material em um papel cartão ou abaixador de língua e então coloque em contato com o líquido fixador.
6. Fixe o material por um período de 6 a 24 horas, agitando o frasco esporadicamente;
7. Mantenha a peça sempre submersa no fixador;
8. Coloque a peça no fixador e não ao contrário. Isso evita que o material fique aderido no fundo do recipiente;
9. Use recipiente de boca larga (tipo frasco de maionese). O processo de fixação promove um "endurecimento". Não use frasco de boca estreita (frasco tipo penicilina), pois com o endurecimento da peça poderá ser impossível removê-la do frasco sem causar prejuízos ao material.

Uso e vantagens do exame citológico em medicina veterinária

O uso das técnicas de citologia diagnóstica vem se expandido em medicina veterinária. A cada ano esta modalidade diagnóstica se difunde devido à praticidade, rapidez e principalmente devido à qualidade de resposta ao clínico e cirurgião dos processos mórbidos em seus pacientes.

A resposta dos exames citológicos enviadas ao laboratório é obtida em dois dias úteis, ao passo que exames histopatológicos, devido ao tipo de preparo da amostra, podem ter resultados liberados em até dez dias corridos. Diante disso o médico veterinário obtém, usando as técnicas de citologia, resposta diagnóstica rápida podendo direcionar o paciente para a terapia clínica, cirúrgica ou para qualquer outro exame complementar em um espaço de tempo menor.

A obtenção de amostras citológicas requer procedimentos minimamente invasivos, freqüentemente indolores, sendo de maneira geral desnecessária a tranqüilização e analgesia do paciente, tornando-se dispensável os riscos inerentes ao uso de técnicas de anestesiologia, principalmente em animais idosos, debilitados, entre outros.

Deve-se ressaltar que a citologia e a histopatologia são procedimentos diagnósticos complementares e devem ser usados em associação. Enquanto a citologia permite obter amostras de forma pouco invasiva, a histopatologia fornece a arquitetura tecidual e permite avaliar a extensão e a invasividade do processo.

Costumeiramente, na prática clínica, os médicos veterinários se deparam com resultados histopatológicos de processos inflamatórios que clinicamente apresentavam características neoplásicas. O inverso também ocorre, basta exemplificarmos com os casos de pequenos mastocitomas que apresentam edema e aumento focal de temperatura, os quais podem ser clinicamente diagnosticados inicialmente como processos inflamatórios. Desta forma, os exames citológicos são de fundamental auxilio para o clínico não submeter o paciente a um procedimento cirúrgico de simples processos inflamatórios e evitar o tratamento clínico em casos de processos neoplásicos.

Dentre os processos inflamatórios, a citologia tem valor indiscutível na visualização de agentes infecciosos, como leveduras, bactérias, protozoários (Ex.: Leishmania spp), ectoparasitas, dentre outros, produzindo o diagnóstico etiológico específico.

A difusão dos métodos ultrassonográficos ampliou sobejamente a variabilidade de lesões a serem colhidas e diagnosticadas, evitando também procedimentos invasivos de colheita.

Como toda técnica diagnóstica, a obtenção da amostra de forma adequada, assim como a preparação das extensões é a principal limitação da técnica. Amostras colhidas, fixadas e enviadas de forma adequada, garantem o processo diagnóstico. Ressalta-se ainda que determinados processos neoplásicos, como por exemplo, hemangiomas e fibromas, devido à forte coesão das células, invariavelmente são inconclusivos ao exame citológico, assim como outras neoplasias não esfoliantes.



Há três grandes modalidades de obtenção de material para exame citológico:


Citologia Esfoliativa:
Consiste em remover as células mais superficiais da lesão através de esfoliação (raspagem), sendo indicada para avaliação do processo de maturação (diferenciação) de epitélios, para caracterização de tipos de exsudatos ou para visualização de agentes infecciosos ou mesmo parasitários. Esta técnica é usada, por exemplo, na determinação da fase do ciclo estral de cadelas, de processos inflamatórios uterinos, habronemoses, etc.


Citologia por Decalque ("imprint"):
Tal modalidade também se baseia na remoção de células superficiais de uma lesão ou da superfície de corte de um órgão, através do contado da superfície em questão com a de uma lâmina de microscopia. É uma técnica muito utilizada em sala de necrópsia para confirmação diagnóstica de suspeitas levantadas à macroscopia, com resposta rápida.


Citologia Aspirativa por Agulha Fina (Punção Aspirativa por Agulha Fina):
Neste método há remoção das células da lesão pela avulsão promovida através da utilização de uma agulha fina (30 mm x 0,7 mm ou 22G). Com esta técnica podemos obter células de vários planos do tecido.
A citologia aspirativa por agulha fina é, sem dúvida, mais interessante que as técnicas anteriores, pois recolhe material muito mais representativo tanto de lesões superficiais como profundas.

Devemos seguir algumas regras básicas para obtenção de bons resultados através da citologia:

Histórico detalhado:
Estas informações são muito importantes, pois indicam o tempo de instalação do processo, como foi o início da lesão, etc.... Estes dados são muitas vezes fundamentais para determinação de diagnósticos diferenciais ou para comentários relativos aos possíveis diagnósticos.

Descrição da lesão:
Uma boa descrição da lesão, como localização precisa do processo e tipo de lesão (nodular, ulcerativa, etc.), auxilia sobejamente o sucesso diagnóstico e permite correlacionar achados citológicos com a lesão macroscópica;


Técnica de colheita:
Este é um dos passos mais importantes para realização da citologia diagnóstica. Uma técnica de colheita inadequada pode impedir a conclusão do caso, pois a amostra colhida deve necessariamente possuir células características da lesão em questão.


Extensões adequadas:
No exame citológico as extensões devem ser feitas seguindo-se os seguites cuidados:
 
a) não comprima o material - especialmente no caso de suspeitas de tumores, pois as células neoplásicas são frágeis;
b) produza extensões delgadas, evitando sobreposição de várias camadas de células, pois a sobreposição impossibilita a coloração e visualização adequada do material;
c) No caso de extensões que serão coradas por corantes hematológicos, desidrate o material, por movimentação ao ar (abane), o mais rápido possível. Não guarde as lâminas úmidas, pois isto causa degeneração celular inviabilizando o resultado.


Técnica de obtenção de material por Citologia Aspirativa com agulha fina:


Material Necessário:
a) Anti-séptico;
b) Seringa plástica descartável de 10 a 20 ml;
c) Agulhas 30 mm x 0,7 mm ou 22 G;
d) Lâminas para microscopia limpas e desengorduradas com álcool;
e) Porta lâminas;
f) Ficha de solicitação de exames.


Preparo do paciente:
Tratando-se de lesões palpáveis não há necessidade de preparos especiais para o paciente, sendo a antissepsia o único procedimento necessário.
 
Lembre-se que a antissepsia é um processo requerido na citologia aspirativa e deve ser ponderado na citologia por esfoliação, pois se deseja-se visualizar o tipo de exsudato ou agente infeccioso, estes poderão ser removidos durante a limpeza do local.


Obtenção do material:
A. Realize a contenção física do paciente de maneira adequada e promova a antissepsia;
B. Acople a agulha à seringa;
C. Fixe a lesão entre o dedo indicador e médio;
D. Mantenha o êmbolo da seringa na posição ZERO.
E. Introduza a agulha na lesão;

F. Promova uma forte pressão negativa no interior da seringa e mantenha-a;
G. Promova com a agulha movimentos de "vai e vem" na lesão e em diversos planos diferentes, mantendo a pressão negativa;
   

CUIDADO: Se por acaso, a agulha sair da lesão, descarte esta agulha e recomece o procedimento escolhendo outro ponto para punção.

ATENÇÃO: Sangue no canhão da agulha ou na seringa não deve ser encarado como sinônimo de boa colheita, pois elementos sangüíneos podem diluir as células que representam o processo.

H. Solte o êmbolo da seringa desfazendo a pressão negativa;
I. Retire a seringa e agulha da lesão;   

J. Desacople a agulha da seringa;
K. Preencha a seringa de ar e acople novamente a agulha;
L. Com o orifício do bisel da agulha voltado para lâmina de microscopia, empurre vigorosamente o êmbolo depositando o conteúdo contido na agulha contra esta. Faça isto na porção central ou em um dos quartos da lâmina;

ATENÇÃO: O material contido na agulha é suficiente para o diagnóstico. A presença de sangue no material causa diluição da amostra, muitas vezes tornando o exame inconclusivo.

M. Promova a extensão encostando uma lâmina extensora à 45º;

N. Não estenda o material até o final da lâmina.    

Outra forma de obtenção de material é a técnica por capilaridade. Usando como base o que foi descrito anteriormente, fixe o tecido a ser puncionado entre os dedos e penetrá-lo com a agulha de calibre "7". Sem retirar a agulha da lesão, movimentá-la em diversas direções com golpes rápidos e vigorosos. Retirar a agulha do tecido. Acoplar a agulha em seringa plástica de 10 ml, previamente preenchida com ar e aspergir o material sobre lâmina e realizar a extensão.

Boa Colheita !

 



As imagens contidas nesta publicação foram extraídas de http://www.labvet.com.br/html/conteudo_informacoes_citologia.htm, sendo a referida página também escrita por este autor. Não há proibição de uso de imagem no site original.